Como cabía esperar, muchas proteasas poseen inhibidores naturales; una célula no podría sobrevivir mucho tiempo si estas poderosas enzimas no estuvieran reguladas. Aunque Northrop y Kunitz identificaron los primeros inhibidores naturales de proteasa como parte de sus estudios de proteasas en la década de 1930, no se comenzó a diseñar inhibidores de proteasa en el laboratorio hasta aproximadamente una década más tarde, e incluso entonces los avances fueron irregulares. En 1949, Arnold Kent Balls, del Laboratorio de investigación regional occidental de Albany, California, descubrió que una sustancia sintética, en concreto un gas nervioso, era capaz de desactivar la acetilcolina esterasa, una enzima relacionada con el proceso de la acetilcolina neuroquímica. Este inhibidor funcionaba al reaccionar con el aminoácido serina en el sitio activo de la enzima. La razón era que las proteasas tripsina, quimotripsina y elastasa también se inactivaban con el gas nervioso, lo que sugería que también poseían el aminoácido serina en sus sitios activos. Los científicos sacaron la conclusión de que todas estas proteínas formaban una familia emparentada por sus mecanismos, un concepto de parentesco que al cabo de otros 20 años resultaría de gran utilidad.

Este concepto se puso a prueba por primera vez en la década de 1970, cuando David W. Cushman y Miguel A. Ondetti, del Instituto Squibb de investigación médica de Princeton, Nueva Jersey, intentaban encontrar un método para controlar la hipertensión. Cushman y Ondetti estaban investigando métodos para inhibir la enzima conversora de angiotensina (ECA), una de las dos proteasas necesarias para fabricar la angiotensina, una hormona localizada en el riñón que aumenta la presión sanguínea. No se disponía de ninguna imagen cristalográfica de la ECA, pero los científicos conocían parte de su funcionamiento. Por una parte, sabían que al menos un inhibidor (una proteína del veneno de una serpiente) funcionaba con la ECA. Por otra parte, sabían que la ECA necesitaba átomos metálicos cargados, o iones, para funcionar, por lo que formaban parte de una familia de proteasas llamadas metaloproteasas que contienen iones metálicos en los sitios activos. Al buscar proteínas similares cuyas estructuras ya se conocieran, Cushman y Ondetti se fijaron en la carboxipeptidasa A, otra metaloproteasa cuya estructura habían descubierto W. Lipscomb y sus colegas algunos años antes en la Universidad de Harvard. Cushman y Ondetti extrapolaron a partir de la forma de la carboxipeptidasa A una predicción para saber qué sustancias químicas podían alterar la actividad de la ECA. Sus esfuerzos tuvieron como resultado el desarrollo en 1979 del inhibidor de ECA captopril, el primer inhibidor de la proteasa desarrollado mediante el proceso de "diseño de fármacos", es decir, el ajuste de un fármaco mediante pruebas y modificaciones paso a paso. El captopril se ha estado utilizando con fines médicos desde entonces.

Se sucedieron más soluciones parecidas a medida que los científicos interesados en encontrar otras sustancias que bajaran la presión sanguínea intentaban descubrir la estructura de la renina, una proteína que funciona conjuntamente con la ECA para fabricar la angiotensina. La renina era muy difícil de cristalizar, pero se obtuvieron pistas sobre su estructura, aunque de una forma indirecta, gracias a investigadores que estaban estudiando la estructura de la enzima digestiva pepsina. Tanto la renina como la pepsina pertenecen a una familia conocida como proteasas aspárticas, debido al aminoácido aspartato de sus sitios activos. Aunque los científicos tomaron las primeras radiografías cristalográficas de la pepsina en la década de 1930, resultó difícil desvelar la estructura de la pepsina. No fue hasta la década de 1970 cuando la investigación sobre la estructura de proteasas ácidas micóticas sirvió de guía para desvelar la estructura de la pepsina de cerdo.

La estructura de la pepsina, a su vez, fue un impulso para los científicos que buscaban un inhibidor de renina. Durante la década de 1980, los investigadores emplearon una ingeniosa técnica para desarrollar inhibidores que detuvieran de forma eficaz la reacción enzimática de la renina. Básicamente, los científicos se centraron en el instante de la reacción en el que la enzima se une más fuertemente al sustrato. Examinaron la estructura del sustrato durante este estado de transición crítico y diseñaron un inhibidor que imitaría no la forma final de la reacción sustrato-enzima, sino la estructura del sustrato durante esta transición altamente atrayente. Aunque estos inhibidores de renina resultaban de gran efectividad en el laboratorio, en el organismo eran metabolizados en el hígado antes de alcanzar los riñones, donde se fabrica la renina. Por lo tanto, los inhibidores de la renina no resultaron eficaces como fármacos para la hipertensión y quedaron archivados, al menos por el momento.

The National Academies

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